人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人Ⅳ型膠原（Col Ⅳ）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。顏色的深淺和樣品中的人Ⅳ型膠原（Col Ⅳ）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
本試劑盒組成如下：
實驗前，要先進行洗滌，本試劑盒洗滌方法如下：
1.自動洗板機：每孔加入洗滌液350μl，注入與吸出間隔60秒。洗板5次。
2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μl，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。洗板5次。
人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。
1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育2小時。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，每個孔中加入工作液100μl(在使用前15分鐘內(nèi)配制)，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。
3.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μl/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
4.每孔加工作液(臨用前15分鐘內(nèi)配制)100μl，加上覆膜，37℃溫育1小時。
5.棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6.每孔加底物溶液100μl，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右(根據(jù)實際顯色的情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現(xiàn)明顯梯度時，即可終止)。
7.每孔加終止液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。
8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
9.實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。
當然，要想實驗結果更加可靠，這些事項也是要引起注意的：
1、濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
2、如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔一孔的OD值），請先將樣本稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數(shù)（×5×n）。
3、各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其正確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)目多，推薦使用排槍加樣。
4、嚴格按照說明書的操縱進行，人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒試驗結果判定須以酶標儀讀數(shù)為準。
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